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In Vivo Dinâmica da Retinal microglia Ativação Durante Neurodegeneration: confocal oftalmoscópico Imagem e morfometria celular no mouse Glaucoma

Published: May 11, 2015
doi:
10.3791/52731
, , ,
1Department of Neurobiology & Anatomy,University of Utah, 2Department of Ophthalmology & Visual Sciences,University of Utah

Summary

Ativação da micróglia e microgliose são respostas fundamentais para a neurodegeneração crónica. Aqui, apresentamos métodos para in vivo, visualização de longo prazo de CX3CR1-GFP + células microgliais da retina por oftalmoscopia confocal, e para limiar e análises morfométricas para identificar e quantificar a sua activação. Monitoramos alterações microgliais durante estágios iniciais de glaucoma relacionada com a idade.

Abstract

A microglia, que são células do SNC neuroimunes residentes, transformar a sua morfologia e tamanho em resposta à lesão do SNC, a mudança para um estado activado com funções distintas e perfis de expressão de gene. Os papéis de ativação microglial na saúde, ferimentos e doenças ainda permanece incompreendida, devido à sua regulamentação dinâmico e complexo em resposta a mudanças no seu microambiente. Assim, é essencial monitorizar de forma não invasiva e analisar as alterações na activação da microglia ao longo do tempo no organismo intacto. Estudos in vivo de ativação microglial ter sido adiada por limitações técnicas ao comportamento microglial rastreamento sem alterar o ambiente CNS. Isso tem sido particularmente desafiador durante a neurodegeneração crónica, onde as mudanças de longo prazo devem ser rastreadas. A retina, um órgão do SNC passíveis de imagens ao vivo não-invasiva, oferece um sistema poderoso para visualizar e caracterizar as dinâmicas da activação da microglia durante a desordens crónicas.

<p class = "jove_content"> Este protocolo descreve métodos de longo prazo, a imagem in vivo de microglia da retina, utilizando oftalmoscopia confocal (cSLO) e CX3CR1 GFP ratos / + repórter, para visualizar microglia com resolução de celular. Além disso, nós descrevemos métodos para quantificar as mudanças mensais de ativação celular e densidade em grandes subconjuntos de células (200-300 células por retina). Confirmamos o uso da área Somal como uma métrica útil para o rastreio ao vivo da ativação microglial na retina através da aplicação de morfometria baseada no limiar automatizada de imagens in vivo. Nós usamos estes aquisição de imagem ao vivo e analisa estratégias para monitorar as mudanças dinâmicas na ativação microglial e microgliose durante as fases iniciais de neurodegeneração da retina em um mouse modelo de glaucoma crônico. Esta abordagem deve ser útil para investigar as contribuições de microglia para declínio neuronal e axonal em doenças crônicas do sistema nervoso central que afetam a retina eo nervo óptico.

Introduction

A microglia são células neuroimunes que reside exclusivamente no sistema nervoso central (SNC) dado que o desenvolvimento embrionário inicial e durante a vida adulta. Equipado com um complexo repertório de receptores, atividade microglial e heterogeneidade regional são regulamentados pela sua interacção bidireccional com os neurônios vizinhos, glia, barreira hemato-encefálica e infiltração de células neuroinflamatórias 1,2. Funções microgliais basais contribuem para a manutenção e reparação fisiológica, uma vez que provar seu território para perturbações na homeostase 3,4. Durante lesão ou doença do SNC, microglia são os primeiros a responder aos sinais neuronais que então desencadeiam a sua transição para um fenótipo reativa, denominado "microglia 2,5-7 ativado. Ativação Microglia envolve um ciclo intrincado da expressão do gene e da proteína, que são acoplados a soma celular e processo de redimensionamento e remodelação 6-9. Activação da microglia, bem como células e redistribuiçãoaglomeração, pode ser acompanhada pelo aumento global local no número de células (denominada microgliose). Isto pode resultar de proliferação celular e de auto-renovação, com ou sem o recrutamento de monócitos sanguíneos derivados de 3,4,7,10-14. Em uma ampla gama de doenças crónicas do SNC, dependentes da idade, sustentada microgliose e ativação da microglia doença paralelo progressão 15-19. Como microglia impacto neurodegeneração permanece obscuro, principalmente porque eles jogam ambos os papéis neuroprotectoras e deletérios que podem ter diversas contribuições para o início da doença e progressão. Estudos de imagem ao vivo que visam a compreensão de doenças crônicas CNS têm monitorado o comportamento microglial no sistema nervoso central danificada de modelos animais e seres humanos, e demonstrou que alterações microgliais são detectáveis ​​início em fases precoces da doença 15-17,19,20. Assim, é crítico para o desenvolvimento de abordagens para detectar e monitorizar a activação da microglia in vivo.

Dete não-invasivocção de mudanças regionais na ativação da microglia cérebro foi estabelecido como um importante indicador de vivo de progressão da doença neurodegenerativa, usando a imagem latente molecular ou bioluminescência e tomografia por emissão de pósitrons ou ressonância magnética 18,21,22. Estes métodos de imagem molecular e nuclear altamente quantitativos e não-invasivos detectar gliosis com resolução regional. Alternativamente, dois fótons de imagem confocal em CX3CR1 GFP / + ratinhos permitiu a observação de microglia do cérebro com resolução celular 3,4,9,20,23-28. No entanto, esta abordagem limita a longo prazo e observação repetida de alterações microgliais crônicas, dado o risco potencial de perturbar o seu comportamento por meio de procedimentos de imagem cerebral, ainda que minimamente invasivos 29. Alternativamente, a retina oferece as condições ideais para a visualização direta, em vivo e monitoramento repetida de microglia em seu nicho CNS intacta durante todo o envelhecimento, após a lesão aguda, epotencialmente durante doenças neurodegenerativas crónicas. Assim, estudos recentes têm demonstrado a viabilidade de imagem de alta resolução de microglia da retina que expressam GFP através da adaptação do oftalmoscópio de varredura confocal laser (cSLO) a imagem ao vivo CX3CR1 GFP / + camundongos. Este foi usado para controlar as alterações semanais em números GFP + células em ratinhos individuais por até 10 semanas após a lesão induzida de forma aguda ou hipertensão ocular 30-36.

Nós estendemos essa abordagem para realizar imagem de longo prazo ao longo de vários meses, e quantitativamente acompanhar as mudanças na ativação da micróglia com base no tamanho soma usando análises morfométricas. Tamanho Somal foi definida como uma métrica útil da activação da microglia, em estudos de imagem ao vivo utilizando dois fotões microscopia confocal em fatias corticais para executar imagiologia in vivo de CX3CR1-GFP + microglia 9. Estes e outros estudos também demonstraram a correlação entre o tamanho Somal e os níveis de expressão da proteína Iba1, which também aumenta com a activação 9,37. Assim, a microglia activada pode ser identificado em ratinhos vivos, e os seus números e de distribuição monitorizada ao longo do tempo durante a saúde e doença do SNC.

Este protocolo descreve métodos para cSLO aquisição e análise de imagens ao vivo para monitorizar o número de células microgliais, distribuição e morfologia durante a activação de células ganglionares (RGC) degeneração da retina (Figura 1). Assim, este estudo utiliza: 1) um modelo de mouse glaucoma herdado (DBA / 2J) que sofre nervo óptico dependente da idade e neurodegeneração da retina e mostra variabilidade notável na progressão da doença entre 5 e 10 meses de idade 38,39, 2) mensal cSLO imagiologia in vivo para a visualização de longo prazo de células GFP + na retina e nervo óptico não mielinizadas de heterozigotos CX3CR1 GFP / + DBA / 2J com idade de 3-5 meses, 3) análise de imagens ao vivo por segmentação e limiar para isolar células e medida somata aIR área. Essas estratégias são aplicados para avaliar a cinética de activação da microglia da retina estados durante os estágios precoces de glaucoma crónico.

Protocol

Imagem in vivo é realizado em instalações isentos de agentes patogénicos usando protocolos aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso do animal Institucional na Universidade de Utah. NOTA: Este protocolo de imagem é usado para ratinhos repórter em que a microglia da retina e monócitos / macrófagos que se infiltram expressar a proteína fluorescente verde (GFP) sob o controlo do locus do receptor de fractalcina (CX3CR1). 1. In vivo de imagens de Retinal GFP + Microgli…

Representative Results

Nossos recente estudos in vivo utilizado aquisição e análise de imagens ao vivo esses métodos para visualizar e controlar a cinética e padrões de ONH e mudanças microgliais da retina durante as fases iniciais do glaucoma crônico e sua relação com a tarde neurodegeneração 59. Aqui, ilustramos um protocolo de aquisição de imagem cSLO para visualizar as células microgliais através de uma grande área da retina central em jovens individuais heterozigotos CX3CR1-GFP DBA / 2J retina <strong…

Discussion

Monitorização vivo do número de células da microglia e activação morfológica durante uma doença neurodegenerativa requer a utilização de métodos de imagem não invasivos que permitem a visualização detalhada das características celulares. Depois de imagem, as células microgliais deve ser isolado (segmentado) para análises morfométricas pelo uso de múltiplos passos de limite para avaliar o tamanho Somal e / ou a complexidade do processo de leituras para a ativação da micróglia. Neste protocolo, descr…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank the Scientific Computing and Imaging Institute of the University of Utah for use of FluoRender software (R01GM09815). This work was supported by grants from the Glaucoma Research Foundation, Melsa M. and Frank Theodore Barr Foundation and the US National Institute of Health, (R01EY020878 and R01EY023621) to M.L.V., and (R01EY017182 and R01EY017950) to B.K.A.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DBA/2J and
CX3CR1-GFP/+ mice		 The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME 000671 and 00582 Mice are breed in-house, introducing new breeders every 3 to 4 generations to prevent genetic drift.
301/2G needle and 1 ml tuberculin slip-tip syringe BD, East Rutherford, NJ 305106 and 309659
2,2,2-tribromoethanol, tert-Amyl alcohol 99% and phosphate buffer saline tablets Sigma-Aldrich, St. Louis, MO T48402, 152463 and P4417 Avertin solution (pH 7.3, sterile filtered) must be freshly made solution or stored at 4ºC for up to 1 week.
Heat therapy T/Pump Gaymar Industries, Orchard Park, NY TP-650
Cotton-tipped applicators Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 23-400-100
Tropicamide 1%  Bausch & Lomb, Rochester, NY NDC 24208-585-64
PMMA contact lenses, 1.70-base curve, 3.2 mm total diameter, 0.40 mm-thick center Cantor & Nissel Ltd., Northamptonshire, UK G003709 Lenses are rinsed with sterile PBS and stored in polypropylene boxes.
HRA/Spectralis confocal scanning laser ophthalmoscope and Eye Explorer software Heidelberg Engineering GmbH, Carlsbad, CA Version 1.7.1.0
PowerPoint Microsoft, Redmond, WA Version 14.4.3
Adobe Photoshop Adobe, San Jose, CA Version CS3
FluoRender Scientific Computing and Imaging Institute, University of Utah Version 2.13 Freeware. http://www.sci.utah.edu/software/13-software/127-fluorender.html
NIS-Elements C Nikon, Melville, NY Version 4.30.01
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Bosco, A., Romero, C. O., Ambati, B. K., Vetter, M. L. In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma. J. Vis. Exp. (99), e52731, doi:10.3791/52731 (2015).
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